畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是最近十多年發(fā)展起來(lái)的真核表達(dá)體系，也是目前最為成功的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)之一，與其它現(xiàn)有的表達(dá)系統(tǒng)相比，畢赤酵母在表達(dá)產(chǎn)物的加工、產(chǎn)物分秘泌到胞外、翻譯后修飾以及糖基化修飾等方面有明顯的優(yōu)勢(shì)，現(xiàn)已廣泛用于外源蛋白的表達(dá)。其中一類(lèi)是甲醇誘導(dǎo)型畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，這類(lèi)表達(dá)系統(tǒng)可以以工業(yè)甲醇作為唯一的碳源，以氨水作為唯一氮源進(jìn)行外源蛋白的表達(dá)。
畢赤酵母發(fā)酵過(guò)程屬于高耗氧發(fā)酵，由于發(fā)酵過(guò)程菌體密度非常高，OUR最高可以達(dá)到150-200mmol/L/h。OUR和CER的大小表征著菌體代謝強(qiáng)度的高低，跟菌體生長(zhǎng)，底物消耗速率，產(chǎn)物生成速率密切相關(guān)，而且對(duì)于高耗氧的發(fā)酵過(guò)程，通氣和機(jī)械攪拌會(huì)消耗大量能源，同時(shí)發(fā)酵過(guò)程中往往伴隨著大量的發(fā)加熱，需要大量的冷卻水。由于溶解氧濃度是供氧和耗氧共同作用的結(jié)果，僅從溶解氧變化趨勢(shì)上，既不能反映出微生物代謝強(qiáng)度的變化也不能反映出設(shè)備供氧能力的優(yōu)劣。當(dāng)發(fā)酵液在這種高耗氧狀態(tài)下，傳統(tǒng)的溶氧電極讀數(shù)幾乎接近零點(diǎn)，溶氧監(jiān)控幾乎已經(jīng)沒(méi)有了指導(dǎo)意義。
在傳統(tǒng)的甲醇誘導(dǎo)型畢赤酵母的發(fā)酵工藝控制中，甲醇補(bǔ)料速率控制是十分關(guān)鍵的。甲醇作為誘導(dǎo)階段唯一碳源，過(guò)量和不足都會(huì)導(dǎo)致目標(biāo)產(chǎn)物的表達(dá)異常。甲醇補(bǔ)料速率過(guò)低會(huì)使得菌體代謝受到限制，外源蛋白表達(dá)速率下降。甲醇補(bǔ)料速率過(guò)大會(huì)使得耗氧速率變大，溶解氧降低，伴隨的是大量副產(chǎn)物例如有機(jī)酸生成。過(guò)量的甲醇往往會(huì)使得畢赤酵母中毒死亡，然而這個(gè)過(guò)程的表現(xiàn)與甲醇補(bǔ)料不足十分相似，經(jīng)驗(yàn)不足的情況下往往會(huì)判斷錯(cuò)誤。一旦判斷錯(cuò)誤往往會(huì)做出加劇中毒的操作，從而造成無(wú)可挽回的經(jīng)濟(jì)損失。
本研究中通過(guò)過(guò)程質(zhì)譜儀和電子鼻對(duì)畢赤酵母發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的尾氣進(jìn)行在線(xiàn)的監(jiān)控，從而計(jì)算出發(fā)酵液中甲醇濃度的變化以及OUR的變化，并根據(jù)這些變化對(duì)甲醇的補(bǔ)加速率進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整。
甲醇的結(jié)構(gòu)式為CH3OH，分子量為32經(jīng)過(guò)電離源后特征碎片m/z為31，在m/z為32處相對(duì)離子強(qiáng)度約為31處的65%，同時(shí)氧氣也會(huì)有極其少量的m/z為31的碎片產(chǎn)生。雖然氧氣在m/z為31的離子強(qiáng)度非常低，但是相對(duì)尾氣中非常低的甲醇的濃度電離出m/z為31的離子強(qiáng)度還是不能忽略的，相反的，甲醇雖然在m/z為32，也就是氧氣的特征峰處碎片強(qiáng)度相當(dāng)于特征峰處的65%，但是其濃度非常低，不會(huì)對(duì)氧氣濃度測(cè)定產(chǎn)生太大的影響。另一個(gè)比較難以克服的問(wèn)題是，目前所能拿到的甲醇標(biāo)準(zhǔn)氣體（氬氣作為平衡氣）都會(huì)混有極少量的空氣，這些極少量的空氣中的氧氣就會(huì)使得甲醇的碎片標(biāo)定變得異常困難，使得標(biāo)定數(shù)值會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于實(shí)際值。為了確定過(guò)程質(zhì)譜儀是否對(duì)發(fā)酵液中甲醇濃度有很好的線(xiàn)性響應(yīng)，我們?cè)?0L反應(yīng)器中配置不同濃度的甲醇水溶液，保持一定的溫度和空氣流量，檢測(cè)尾氣質(zhì)譜m/z31處離子電流對(duì)經(jīng)過(guò)不同濃度的甲醇水溶液后空氣的響應(yīng)情況。圖 5.1中可以看出，過(guò)程質(zhì)譜儀m/z為31處的離子電流強(qiáng)度與甲醇水溶液中甲醇的濃度是線(xiàn)性相關(guān)的，由于空氣中氧氣也有極少量的m/z為31的碎片產(chǎn)生，所以，這條擬合出來(lái)的直線(xiàn)不會(huì)經(jīng)過(guò)原點(diǎn)。

圖1. 過(guò)程質(zhì)譜對(duì)甲醇的響應(yīng)

畢赤酵母發(fā)酵過(guò)程監(jiān)控（生長(zhǎng)期）
在畢赤酵母發(fā)酵過(guò)程中，能被電子鼻靈敏監(jiān)控到的物質(zhì)多為醇類(lèi)和有機(jī)酸類(lèi)。有機(jī)酸多在溶氧較低時(shí)開(kāi)始積累，在主要碳源消耗殆盡后開(kāi)始消耗這些積累的有機(jī)酸。電子鼻對(duì)醇類(lèi)的靈敏程度遠(yuǎn)高于對(duì)有機(jī)酸的靈敏度，因此，當(dāng)開(kāi)始甲醇誘導(dǎo)后，電子鼻對(duì)甲醇的響應(yīng)就掩蓋了對(duì)有機(jī)酸的響應(yīng)。圖 5.2是采用電子鼻對(duì)畢赤酵母表達(dá)過(guò)程進(jìn)行監(jiān)控的曲線(xiàn)，圖示階段為甘油作為碳源，接種后隨著菌體的生長(zhǎng)OUR開(kāi)始變大，溶解氧開(kāi)始下降，下降到設(shè)定下限后開(kāi)始采用溶氧轉(zhuǎn)速聯(lián)動(dòng)控制溶氧。在12小時(shí)處，溶氧到達(dá)低點(diǎn)，此時(shí)電子鼻對(duì)過(guò)程尾氣開(kāi)始有響應(yīng)，并且一直在變大直到基礎(chǔ)料中甘油被耗盡，溶解氧快速回升，電子鼻對(duì)尾氣的響應(yīng)值開(kāi)始迅速下降。再次流加甘油后溶氧迅速下降，OUR回升，一段時(shí)間后電子鼻的響應(yīng)值有一次開(kāi)始變大。在誘導(dǎo)前停止甘油流加后，這一現(xiàn)象再一次出現(xiàn)。另一個(gè)重要的生理代謝參數(shù)RQ的變化也證實(shí)了這一點(diǎn)。畢赤酵母以甘油作為唯一碳源生產(chǎn)時(shí)，RQ一般在0.6-0.7左右，菌體再次利用由于碳源不完全氧化而生成的有機(jī)物時(shí)，RQ一般會(huì)高于這種碳源完全氧化時(shí)的RQ。在每一次甘油耗盡、OUR下降、溶氧迅速上升時(shí)，RQ會(huì)由原來(lái)的0.6-0.7上升到1.0左右。

圖2. 電子鼻監(jiān)控畢赤酵母表達(dá)過(guò)程

在甲醇誘導(dǎo)型畢赤酵母表達(dá)過(guò)程中，為了使酵母細(xì)胞快速的由生長(zhǎng)階段轉(zhuǎn)換到誘導(dǎo)階段，其中一種常見(jiàn)的方法就是甘油補(bǔ)料停止后繼續(xù)等待一段時(shí)間直到培養(yǎng)基殘余的碳源全部消耗。傳統(tǒng)工藝是以溶氧快速回升到70%以上后繼續(xù)碳源饑餓半小時(shí)以上，沒(méi)有從反應(yīng)器內(nèi)實(shí)際碳源消耗情況來(lái)確定誘導(dǎo)開(kāi)始時(shí)間。采用過(guò)程質(zhì)譜儀和電子鼻對(duì)畢赤酵母表達(dá)過(guò)程進(jìn)行監(jiān)控后，我們可以直接根據(jù)發(fā)酵液中碳源濃度或者實(shí)際發(fā)酵液中菌體耗氧速率來(lái)確定誘導(dǎo)的開(kāi)始時(shí)間。
畢赤酵母發(fā)酵過(guò)程監(jiān)控（誘導(dǎo)期）
畢赤酵母進(jìn)入誘導(dǎo)期以后，甲醇的補(bǔ)料速率和甲醇的殘余量控制是十分關(guān)鍵的。從理論上來(lái)說(shuō)，我們可以建立一個(gè)模型，根據(jù)菌體濃度、菌體耗氧情況以及設(shè)備供氧情況等多個(gè)參數(shù)來(lái)計(jì)算出合適的補(bǔ)料速率。但是，僅僅靠模型建立的前饋控制是十分不可靠的，并且由于酵母菌體甲醇中毒的癥狀與補(bǔ)料不足癥狀有一些相似之處，根據(jù)模型建立的前饋控制有可能向著相反的方向進(jìn)行。所以，我們要根據(jù)我們能夠獲取的數(shù)據(jù)建立反饋控制的方法。
圖 3中，紅色箭頭為開(kāi)始加入甲醇的時(shí)間點(diǎn)，可以看到溶氧開(kāi)始下降的時(shí)候，電子鼻大部分通道立即開(kāi)始有了強(qiáng)烈的響應(yīng)（圖3a），少數(shù)幾個(gè)通道幾乎達(dá)到最大響應(yīng)10，甲醇開(kāi)始為勻速流加。隨著酵母菌體消耗甲醇速率的加快，OUR上升導(dǎo)致溶解氧開(kāi)始下降（圖 3b），與此同時(shí)，在此前積累的少量甲醇被消耗導(dǎo)致甲醇?xì)堄酀舛认陆?，電子鼻的響?yīng)也同時(shí)開(kāi)始下降。當(dāng)下降到一定濃度后進(jìn)入碳源限制狀態(tài)后，甲醇的殘余濃度下降開(kāi)始變緩，同時(shí)溶氧開(kāi)始回升。增加甲醇的補(bǔ)加速率后，相同的現(xiàn)象再次出現(xiàn)，當(dāng)觀察到甲醇濃度再次下降后，又及時(shí)的增加了甲醇的補(bǔ)料速率，在45-46小時(shí)左右有仍然有一個(gè)短暫的溶氧回升趨勢(shì)的出現(xiàn)。每一次增加甲醇的補(bǔ)料速率后，OUR都會(huì)變得更高，溶氧會(huì)進(jìn)一步下降。但是，在這種甲醇濃度下，過(guò)程質(zhì)譜幾乎沒(méi)有有規(guī)律的響應(yīng)。

圖3. 誘導(dǎo)初期電子鼻、溶氧和質(zhì)譜對(duì)甲醇的響應(yīng)

隨著酵母菌體對(duì)甲醇利用的增加，甲醇的補(bǔ)料速率隨之加快，進(jìn)而甲醇的殘余濃度開(kāi)始上升。圖 5.4中顯示了整個(gè)過(guò)程中過(guò)程質(zhì)譜儀和電子鼻監(jiān)控到的數(shù)據(jù)，可以發(fā)現(xiàn)兩者在60小時(shí)以后甲醇?xì)堄酀舛冗_(dá)到比較高的值以后就具有非常好的對(duì)應(yīng)關(guān)系。通過(guò)兩臺(tái)儀器獲取的數(shù)據(jù)進(jìn)行線(xiàn)性擬合（圖 5.5）發(fā)現(xiàn)，兩者的線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)都達(dá)到了90%以上。有一個(gè)值得注意的問(wèn)題就是，電子鼻的響應(yīng)與甲醇濃度并不成線(xiàn)性關(guān)系，除非是在甲醇濃度非常低或者接近最大響應(yīng)時(shí)會(huì)近似呈線(xiàn)性關(guān)系的，而過(guò)程質(zhì)譜儀的數(shù)據(jù)是與甲醇濃度呈線(xiàn)性關(guān)系的。因此，我們可以合理的做出推測(cè)，電子鼻對(duì)甲醇響應(yīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)比質(zhì)譜對(duì)甲醇的靈敏度高，但是檢測(cè)范圍卻小得多，在質(zhì)譜儀開(kāi)始對(duì)甲醇能夠做出響應(yīng)時(shí)，電子鼻已經(jīng)幾乎達(dá)到檢測(cè)上限。

圖4. 畢赤酵母全過(guò)程尾氣數(shù)據(jù)

圖 5. 電子鼻響應(yīng)和過(guò)程質(zhì)譜響應(yīng)線(xiàn)性擬合

為了觀察畢赤酵母甲醇中毒的過(guò)程，我們用正常甲醇補(bǔ)料速率4倍的速率補(bǔ)加甲醇（圖6）。剛開(kāi)始進(jìn)入誘導(dǎo)階段時(shí)，與預(yù)料的一樣，由于甲醇的消耗pH下降（圖 6a，pH設(shè)置為5）、OUR快速升高（圖 6c）、溶氧下降（圖 6b），過(guò)程質(zhì)譜儀和電子鼻對(duì)甲醇的響應(yīng)信號(hào)變大（圖 6d、圖 6e）。隨著甲醇濃度的增加，酵母菌體開(kāi)始進(jìn)入輕微中毒狀態(tài)，pH出現(xiàn)回升，OUR開(kāi)始下降隨之溶氧比較慢的上升（與碳源耗竭相比）。發(fā)酵41小時(shí)后停止甲醇流加，又經(jīng)過(guò)5個(gè)小時(shí)左右，甲醇濃度逐漸的下降，酵母中毒狀態(tài)逐漸解除，出現(xiàn)了與甲醇第一次開(kāi)始流加類(lèi)似的現(xiàn)象，pH下降，OUR上升溶解氧下降的現(xiàn)象。但是由于中毒過(guò)程是逐漸恢復(fù)，所以，OUR在停止甲醇補(bǔ)加后還繼續(xù)下降了一段時(shí)間后不在變化，直到甲醇濃度下降到一定程度才開(kāi)始上升。殘余甲醇一直消耗到發(fā)酵55小時(shí)，殘余的甲醇幾乎耗盡，OUR快速下降進(jìn)而溶解氧迅速回升。由于電子鼻對(duì)甲醇的響應(yīng)是非線(xiàn)性的，并且檢測(cè)上限非常低，所以，當(dāng)甲醇濃度接近電子鼻的檢測(cè)上限后就無(wú)法靈敏的反應(yīng)出發(fā)酵液中甲醇的含量。過(guò)程質(zhì)譜儀也監(jiān)測(cè)到甲醇濃度的變化。

圖6. 畢赤酵母甲醇中毒現(xiàn)象