接種/移種

火焰圈保護接種

準備工作：操作人數(shù)以3人最佳，非操作人員離開房間，操作人員帶好口罩，隔熱手套；關(guān)閉門窗、空調(diào)風扇；3人分別負責持接種鉗、傳遞種瓶和接種。
注意：嚴禁帶橡膠或者塑料薄膜手套，一旦發(fā)生燒傷會更嚴重。
? 用濕抹布蓋住攪拌電機以及周圍管道，以防止電機和硅膠管被燒壞。
? 向火圈棉花上滴加無水酒精至飽和并置于接種口。
? 關(guān)小進氣流量，全開尾氣閥門。
? 預(yù)先擰松接種口蓋子。
? 持接種鉗者用接種鉗鉗住接種口蓋子，點燃火圈，用接種鉗擰下接種口蓋子，并置于接種口遠離接種者方向，蓋子內(nèi)測朝向火焰。
? 傳遞種子瓶者將捆扎棉線解下，如是棉塞，將棉塞外部包裹紗布取下，遞給接種者。
? 接種者在火焰旁邊取下種瓶紗布或棉塞，火燒種瓶瓶口一圈后緩慢將種子液倒入罐中。然后遞給傳遞種瓶者，同時，傳遞種瓶者將下一瓶種子遞給接種者。
? 所有接種完成后持接種鉗者擰上罐蓋，用濕抹布熄滅火圈，恢復(fù)罐壓和通氣。
注意： 預(yù)先估計接種時間，保證火焰時間足夠長，如果種瓶數(shù)量較多，預(yù)先合瓶。
注意：接種速度不宜過快，否則可能會導(dǎo)致種子液溢出，導(dǎo)致無菌失效。
注意：接種后和種瓶上部溫度很高，禁止手持種瓶上部。
注意：嚴禁向燃燒的火圈上添加酒精。
注意：火圈掉落地面后立即用濕抹布覆蓋。

移種管道移種

準備工作：

? 記錄此時所有發(fā)酵罐重量。
? 取下種子罐、發(fā)酵罐的取樣口末端，連接移種管道。
注意：移種準備需要約40min，注意在移種前完成所有準備操作

移種管道消毒：

? 依次從種子罐的最遠端到種子罐打開蒸汽進罐底閥、取樣閥，打開種子罐的移種管道排凝閥門，消毒30min。
? 記錄此時最遠端發(fā)酵罐的罐重。

消毒結(jié)束：

? 關(guān)閉移種管道排凝閥門，依次從種子罐到最遠端發(fā)酵罐關(guān)閉蒸汽進罐底閥，罐底最后一個發(fā)酵罐罐底進蒸汽閥門后立即打開此罐罐底閥，維持移種管道壓力。
? 待移種管道冷卻。

移種:

? 升高種子罐罐壓至0.1MPa，維持發(fā)酵罐罐壓0.05Mpa，從最遠端發(fā)酵罐開始移種。
? 最遠的發(fā)酵罐移種計量初始值以第二次記錄的罐重為準，計算移入指定量的種子液后罐重。移種時，打開種子罐罐底閥，到達目標罐重后關(guān)閉發(fā)酵罐罐底閥，保持種子罐罐底閥開啟。
? 從次遠端發(fā)酵罐開始，以當前的罐重作為計量初始值，計算移入指定量的種子液后罐重。打開對應(yīng)發(fā)酵罐罐底閥，等待到達目標罐重后，關(guān)閉罐底閥。過程中保持種子罐罐底閥開啟。

移種結(jié)束

? 所有移種完成后，關(guān)閉種子罐罐底閥，將種子罐與移種管道連接斷開（可能會有發(fā)酵液濺出），移種管道置于水中，從最遠端開始開啟所有發(fā)酵罐的蒸汽進罐底閥，用蒸汽將移種管道沖洗干凈。關(guān)閉所有蒸汽進罐底閥。
? 取下移種管道，恢復(fù)取樣口，（根據(jù)情況，如果需要取種后樣）再次打開蒸汽進罐底閥對罐底閥繼續(xù)蒸汽消毒。
? 記錄此時所有發(fā)酵罐罐重，與第一次記錄的差值作為實際接種量。
? 清理移種管道中排出的發(fā)酵液，根據(jù)需要處理種子罐。

培養(yǎng)

補料

補料瓶制作

? 制作補料棉塞：取合適大小方形雙層紗布，中間依照補料硅膠管管徑大小穿孔，瓶內(nèi)硅膠管長度到平底，將紗布蒙住瓶口，硅膠管置于中央，逐層填充棉花，直到紗布進入瓶內(nèi)2/3，繼續(xù)在瓶口堆棉花，然后扎緊紗布。
注意：棉花不能使用醫(yī)用脫脂棉。
注意：瓶內(nèi)管口要斜切，防止吸附到瓶壁無法出液。
注意；棉花填充松緊程度以拔出棉塞能聽到砰的一聲為好。
? 連接補料針頭：將硅膠管出口一側(cè)連接補料針頭，并用扎帶或者棉繩扎緊。

補料瓶的計量

? 記錄空瓶質(zhì)量（包括棉塞和硅膠管），固體料質(zhì)量，溶解后質(zhì)量，消后質(zhì)量。
? 瓶中溶液質(zhì)量濃度=固體料質(zhì)量/（消后質(zhì)量-空瓶質(zhì)量）

補料瓶的消毒

? 將補料針裝入無蓋的10mL離心管，在離心管口處對折，用紗布和牛皮紙包扎。
? 在補料管靠近瓶口處用棉線或者止水夾加死管道。
? 放入滅菌鍋消毒。

補料的連接

? 擰松補料接口帽。
? 點燃酒精棉球并置于補料口旁邊。
? 擰開補料接口。
? 取出補料針。
? 對準補料硅膠墊中心位置，豎直扎入。
? 熄滅酒精棉球。
? 用75%酒精棉球塞住補料針周圍位置。
? 管道裝入蠕動泵并加緊。
? 打開止水夾。
注意：消泡和pH控制的補料瓶制作同上，以下不再敘述。氨水、甲醇屬于易揮發(fā)物質(zhì)通常情況下無需并且不能進行高溫消毒。

自動/手動補料

? 手動補料：按下面板上手動補料按鈕，補料泵將持續(xù)轉(zhuǎn)動，直到到達所需補料量。
? 自動補料：按下面板上自動補料按鈕，補料泵將按照設(shè)定的占空比控制泵的開停。

換料

? 當一瓶補料接近用完時，在控制面板上停止自動或者手動補料。
? 按下?lián)Q料按鈕。
? 將補料針頭從補料硅膠墊上拔出，塞入一小團酒精棉，擰上補料口蓋。
? 將補料管用止水夾夾住并從蠕動泵上取下。
? 按照上述方法將一瓶新的補料連接到一個未用過的補料口。
? 控制面板上關(guān)閉換料操作。
? 繼續(xù)按照工藝補料。
注意：如果沒有點擊換料按鈕，會使得補料累計不準確。

消泡

? 手動消泡，按下面板上手動按鈕，消泡泵將持續(xù)轉(zhuǎn)動泵入消泡劑。
? 自動消泡，連接好液位傳感器，當有泡沫時，系統(tǒng)報警，同時啟動消泡泵，按照設(shè)定的占空比補加消泡劑。
? 作為補料，按下消泡模式，可將消泡泵作為補料泵使用，方法同上所述。

pH控制

? 首先確定發(fā)酵過程中pH控制方向，在面板上確認控制方式。
? 連接好酸（堿），點下面板上的pH自動。當pH向控制方向的反方向偏移超過設(shè)定值后，就會自動補加酸（堿）。

取樣

? 取樣前消毒：打開罐底進蒸汽閥，取樣閥，排出管道內(nèi)冷凝水；關(guān)小取樣閥，維持取樣口有少許蒸汽和冷凝水排出，維持20min。
? 取樣：關(guān)閉蒸汽進罐底閥，打開罐底閥，排出少量料液后，用離心管或者小三角瓶取樣，取樣后關(guān)閉罐底閥。
? 取樣后消毒：打開罐底進蒸汽閥，排出管道內(nèi)殘余發(fā)酵液后，關(guān)小取樣閥，維持取樣口有少許蒸汽和冷凝水排出，維持20min，關(guān)閉蒸汽進罐底閥，關(guān)閉取樣閥。

結(jié)束

停止發(fā)酵

? 關(guān)閉所有自控（溫度、pH、流量、攪拌、DO）
? 關(guān)閉空氣進罐體隔膜閥
? 關(guān)閉尾氣冷凝進水回水閥門
? 排氣閥門全開
? 關(guān)閉尾氣分析閥門
注意：若在連續(xù)使用中減少過濾器消毒次數(shù)，關(guān)閉質(zhì)量流量計之前打開質(zhì)量流量計旁路閥門，然后關(guān)閉空氣進罐體隔膜閥以保證過濾器前正壓。

滅活發(fā)酵液

? 蒸汽煮：開攪拌200rpm，關(guān)閉夾套進水閥門，夾套排水閥門，打開夾套排凝閥門，夾套進蒸汽閥門，將罐溫升高到100℃，維持10min，降溫，排放處理
? 堿水泡：直接將發(fā)酵液排放到水桶，加入適量的片堿，浸泡2小時以上，排放處理
注意：如果發(fā)酵液有后處理，按后處理需要進行處理。

清洗

? 拆下電機電源線、電極測速線、壓力傳感器變送線、視鏡燈。
? 拆下pH、DO電極，用水清洗干凈分別浸入飽和KCl和水中；電極口裝上悶頭。
? 取下排氣冷凝器，并清洗。
? 取下補料針頭。
? 取下電機妥善放好。
? 取下所有罐蓋連接螺絲。
? 拉住罐蓋提手取下罐蓋，取罐蓋過程中，攪拌軸不得與罐壁碰撞，不得用手握攪拌軸，取出后攪拌軸朝上放置。
? 清洗罐蓋和罐體，必要時擰下罐底進行清洗。
? 清洗完畢后將罐蓋放回，接種口朝外，邊緣對齊，擰緊罐蓋（對稱擰緊）。
? 電機接口朝后裝回電機，擰緊電機固定螺絲，連接電機電源和測速。
? 安裝排氣冷凝罐和尾氣管。
? 若要長期不用，用空氣將罐內(nèi)吹干。