畢赤酵母表達系統(tǒng)是最近十多年發(fā)展起來的真核表達體系，也是目前最為成功的外源蛋白表達系統(tǒng)之一，與其它現(xiàn)有的表達系統(tǒng)相比，畢赤酵母在表達產(chǎn)物的加工、產(chǎn)物分秘泌到胞外、翻譯后修飾以及糖基化修飾等方面有明顯的優(yōu)勢，現(xiàn)已廣泛用于外源蛋白的表達。其中一類是甲醇誘導型畢赤酵母表達系統(tǒng)，這類表達系統(tǒng)可以以工業(yè)甲醇作為唯一的碳源，以氨水作為唯一氮源進行外源蛋白的表達。
畢赤酵母發(fā)酵過程屬于高耗氧發(fā)酵，由于發(fā)酵過程菌體密度非常高，OUR最高可以達到150-200mmol/L/h。OUR和CER的大小表征著菌體代謝強度的高低，跟菌體生長，底物消耗速率，產(chǎn)物生成速率密切相關，而且對于高耗氧的發(fā)酵過程，通氣和機械攪拌會消耗大量能源，同時發(fā)酵過程中往往伴隨著大量的發(fā)加熱，需要大量的冷卻水。由于溶解氧濃度是供氧和耗氧共同作用的結果，僅從溶解氧變化趨勢上，既不能反映出微生物代謝強度的變化也不能反映出設備供氧能力的優(yōu)劣。當發(fā)酵液在這種高耗氧狀態(tài)下，傳統(tǒng)的溶氧電極讀數(shù)幾乎接近零點，溶氧監(jiān)控幾乎已經(jīng)沒有了指導意義。
在傳統(tǒng)的甲醇誘導型畢赤酵母的發(fā)酵工藝控制中，甲醇補料速率控制是十分關鍵的。甲醇作為誘導階段唯一碳源，過量和不足都會導致目標產(chǎn)物的表達異常。甲醇補料速率過低會使得菌體代謝受到限制，外源蛋白表達速率下降。甲醇補料速率過大會使得耗氧速率變大，溶解氧降低，伴隨的是大量副產(chǎn)物例如有機酸生成。過量的甲醇往往會使得畢赤酵母中毒死亡，然而這個過程的表現(xiàn)與甲醇補料不足十分相似，經(jīng)驗不足的情況下往往會判斷錯誤。一旦判斷錯誤往往會做出加劇中毒的操作，從而造成無可挽回的經(jīng)濟損失。
本研究中通過過程質(zhì)譜儀和電子鼻對畢赤酵母發(fā)酵過程中產(chǎn)生的尾氣進行在線的監(jiān)控，從而計算出發(fā)酵液中甲醇濃度的變化以及OUR的變化，并根據(jù)這些變化對甲醇的補加速率進行相應的調(diào)整。
甲醇的結構式為CH3OH，分子量為32經(jīng)過電離源后特征碎片m/z為31，在m/z為32處相對離子強度約為31處的65%，同時氧氣也會有極其少量的m/z為31的碎片產(chǎn)生。雖然氧氣在m/z為31的離子強度非常低，但是相對尾氣中非常低的甲醇的濃度電離出m/z為31的離子強度還是不能忽略的，相反的，甲醇雖然在m/z為32，也就是氧氣的特征峰處碎片強度相當于特征峰處的65%，但是其濃度非常低，不會對氧氣濃度測定產(chǎn)生太大的影響。另一個比較難以克服的問題是，目前所能拿到的甲醇標準氣體（氬氣作為平衡氣）都會混有極少量的空氣，這些極少量的空氣中的氧氣就會使得甲醇的碎片標定變得異常困難，使得標定數(shù)值會遠遠大于實際值。為了確定過程質(zhì)譜儀是否對發(fā)酵液中甲醇濃度有很好的線性響應，我們在50L反應器中配置不同濃度的甲醇水溶液，保持一定的溫度和空氣流量，檢測尾氣質(zhì)譜m/z31處離子電流對經(jīng)過不同濃度的甲醇水溶液后空氣的響應情況。圖 5.1中可以看出，過程質(zhì)譜儀m/z為31處的離子電流強度與甲醇水溶液中甲醇的濃度是線性相關的，由于空氣中氧氣也有極少量的m/z為31的碎片產(chǎn)生，所以，這條擬合出來的直線不會經(jīng)過原點。

圖1. 過程質(zhì)譜對甲醇的響應

畢赤酵母發(fā)酵過程監(jiān)控（生長期）
在畢赤酵母發(fā)酵過程中，能被電子鼻靈敏監(jiān)控到的物質(zhì)多為醇類和有機酸類。有機酸多在溶氧較低時開始積累，在主要碳源消耗殆盡后開始消耗這些積累的有機酸。電子鼻對醇類的靈敏程度遠高于對有機酸的靈敏度，因此，當開始甲醇誘導后，電子鼻對甲醇的響應就掩蓋了對有機酸的響應。圖 5.2是采用電子鼻對畢赤酵母表達過程進行監(jiān)控的曲線，圖示階段為甘油作為碳源，接種后隨著菌體的生長OUR開始變大，溶解氧開始下降，下降到設定下限后開始采用溶氧轉速聯(lián)動控制溶氧。在12小時處，溶氧到達低點，此時電子鼻對過程尾氣開始有響應，并且一直在變大直到基礎料中甘油被耗盡，溶解氧快速回升，電子鼻對尾氣的響應值開始迅速下降。再次流加甘油后溶氧迅速下降，OUR回升，一段時間后電子鼻的響應值有一次開始變大。在誘導前停止甘油流加后，這一現(xiàn)象再一次出現(xiàn)。另一個重要的生理代謝參數(shù)RQ的變化也證實了這一點。畢赤酵母以甘油作為唯一碳源生產(chǎn)時，RQ一般在0.6-0.7左右，菌體再次利用由于碳源不完全氧化而生成的有機物時，RQ一般會高于這種碳源完全氧化時的RQ。在每一次甘油耗盡、OUR下降、溶氧迅速上升時，RQ會由原來的0.6-0.7上升到1.0左右。

圖2. 電子鼻監(jiān)控畢赤酵母表達過程

在甲醇誘導型畢赤酵母表達過程中，為了使酵母細胞快速的由生長階段轉換到誘導階段，其中一種常見的方法就是甘油補料停止后繼續(xù)等待一段時間直到培養(yǎng)基殘余的碳源全部消耗。傳統(tǒng)工藝是以溶氧快速回升到70%以上后繼續(xù)碳源饑餓半小時以上，沒有從反應器內(nèi)實際碳源消耗情況來確定誘導開始時間。采用過程質(zhì)譜儀和電子鼻對畢赤酵母表達過程進行監(jiān)控后，我們可以直接根據(jù)發(fā)酵液中碳源濃度或者實際發(fā)酵液中菌體耗氧速率來確定誘導的開始時間。
畢赤酵母發(fā)酵過程監(jiān)控（誘導期）
畢赤酵母進入誘導期以后，甲醇的補料速率和甲醇的殘余量控制是十分關鍵的。從理論上來說，我們可以建立一個模型，根據(jù)菌體濃度、菌體耗氧情況以及設備供氧情況等多個參數(shù)來計算出合適的補料速率。但是，僅僅靠模型建立的前饋控制是十分不可靠的，并且由于酵母菌體甲醇中毒的癥狀與補料不足癥狀有一些相似之處，根據(jù)模型建立的前饋控制有可能向著相反的方向進行。所以，我們要根據(jù)我們能夠獲取的數(shù)據(jù)建立反饋控制的方法。
圖 3中，紅色箭頭為開始加入甲醇的時間點，可以看到溶氧開始下降的時候，電子鼻大部分通道立即開始有了強烈的響應（圖3a），少數(shù)幾個通道幾乎達到最大響應10，甲醇開始為勻速流加。隨著酵母菌體消耗甲醇速率的加快，OUR上升導致溶解氧開始下降（圖 3b），與此同時，在此前積累的少量甲醇被消耗導致甲醇殘余濃度下降，電子鼻的響應也同時開始下降。當下降到一定濃度后進入碳源限制狀態(tài)后，甲醇的殘余濃度下降開始變緩，同時溶氧開始回升。增加甲醇的補加速率后，相同的現(xiàn)象再次出現(xiàn)，當觀察到甲醇濃度再次下降后，又及時的增加了甲醇的補料速率，在45-46小時左右有仍然有一個短暫的溶氧回升趨勢的出現(xiàn)。每一次增加甲醇的補料速率后，OUR都會變得更高，溶氧會進一步下降。但是，在這種甲醇濃度下，過程質(zhì)譜幾乎沒有有規(guī)律的響應。

圖3. 誘導初期電子鼻、溶氧和質(zhì)譜對甲醇的響應

隨著酵母菌體對甲醇利用的增加，甲醇的補料速率隨之加快，進而甲醇的殘余濃度開始上升。圖 5.4中顯示了整個過程中過程質(zhì)譜儀和電子鼻監(jiān)控到的數(shù)據(jù)，可以發(fā)現(xiàn)兩者在60小時以后甲醇殘余濃度達到比較高的值以后就具有非常好的對應關系。通過兩臺儀器獲取的數(shù)據(jù)進行線性擬合（圖 5.5）發(fā)現(xiàn)，兩者的線性相關系數(shù)都達到了90%以上。有一個值得注意的問題就是，電子鼻的響應與甲醇濃度并不成線性關系，除非是在甲醇濃度非常低或者接近最大響應時會近似呈線性關系的，而過程質(zhì)譜儀的數(shù)據(jù)是與甲醇濃度呈線性關系的。因此，我們可以合理的做出推測，電子鼻對甲醇響應遠遠比質(zhì)譜對甲醇的靈敏度高，但是檢測范圍卻小得多，在質(zhì)譜儀開始對甲醇能夠做出響應時，電子鼻已經(jīng)幾乎達到檢測上限。

圖4. 畢赤酵母全過程尾氣數(shù)據(jù)

圖 5. 電子鼻響應和過程質(zhì)譜響應線性擬合

為了觀察畢赤酵母甲醇中毒的過程，我們用正常甲醇補料速率4倍的速率補加甲醇（圖6）。剛開始進入誘導階段時，與預料的一樣，由于甲醇的消耗pH下降（圖 6a，pH設置為5）、OUR快速升高（圖 6c）、溶氧下降（圖 6b），過程質(zhì)譜儀和電子鼻對甲醇的響應信號變大（圖 6d、圖 6e）。隨著甲醇濃度的增加，酵母菌體開始進入輕微中毒狀態(tài)，pH出現(xiàn)回升，OUR開始下降隨之溶氧比較慢的上升（與碳源耗竭相比）。發(fā)酵41小時后停止甲醇流加，又經(jīng)過5個小時左右，甲醇濃度逐漸的下降，酵母中毒狀態(tài)逐漸解除，出現(xiàn)了與甲醇第一次開始流加類似的現(xiàn)象，pH下降，OUR上升溶解氧下降的現(xiàn)象。但是由于中毒過程是逐漸恢復，所以，OUR在停止甲醇補加后還繼續(xù)下降了一段時間后不在變化，直到甲醇濃度下降到一定程度才開始上升。殘余甲醇一直消耗到發(fā)酵55小時，殘余的甲醇幾乎耗盡，OUR快速下降進而溶解氧迅速回升。由于電子鼻對甲醇的響應是非線性的，并且檢測上限非常低，所以，當甲醇濃度接近電子鼻的檢測上限后就無法靈敏的反應出發(fā)酵液中甲醇的含量。過程質(zhì)譜儀也監(jiān)測到甲醇濃度的變化。

圖6. 畢赤酵母甲醇中毒現(xiàn)象